Cách nhận biết vi khuẩn

NộI Dung

• giai đoạn
• Phương pháp 1 Xác định vi khuẩn bằng nhuộm Gram
• Phương pháp 2 Thực hiện phép thử nhuộm Ziehl-Neelsen
• Phương pháp 3 Nghiên cứu hành vi và sự xuất hiện của vi khuẩn
• Phương pháp 4 Giải thích tất cả các kết quả

Trong bài viết này: Xác định vi khuẩn bằng nhuộm Gram Thực hiện xét nghiệm nhuộm Ziehl-Neelsen Thực hiện hành vi và sự xuất hiện của vi khuẩn Kết hợp tất cả các kết quả43 Tài liệu tham khảo

Việc xác định vi khuẩn là một nhiệm vụ phức tạp. Một trong những lý do là theo ước tính, có khoảng 10 000 đến 1 tỷ loài vi khuẩn trên thế giới! Xác định đúng vi khuẩn là rất quan trọng, đặc biệt là trong lĩnh vực y tế, nơi điều trị đúng bệnh phụ thuộc phần lớn vào loại vi khuẩn gây ra vấn đề. Trong hầu hết các trường hợp, việc xác định được thực hiện trên cơ sở loại bỏ. Để xác định vi khuẩn, bạn phải thực hiện các xét nghiệm nhuộm màu, phân tích sự xuất hiện của nó và quan sát cách nó phản ứng tốt với các điều kiện khác nhau. Nếu bạn cần một kết quả nhanh chóng, hãy lấy một mẫu DNA để gửi đến phòng thí nghiệm.

giai đoạn

Phương pháp 1 Xác định vi khuẩn bằng nhuộm Gram

1. xác định nếu vi khuẩn gram dương hoặc âm tính. Nhuộm gram là phương pháp phân chia vi khuẩn giữa hai loại phổ biến nhất: Gram dương và Gram âm. Loại trước có thành tế bào dày bao gồm một loại polymer gọi là peptidoglycan, có màu tốt nhất là thành mỏng của vi khuẩn gram âm.
   • Một số loại vi khuẩn gram dương phổ biến là streptococci, staphylococci, micrococci (hoặc micrococci) và listeria.
   • Dưới đây là một số ví dụ phổ biến về vi khuẩn gram âm: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium và Campylobacter.
2. Thực hiện các biện pháp bảo vệ thích hợp. Các vi khuẩn và các yếu tố hóa học bạn sẽ sử dụng trong quá trình thử nghiệm có nguy cơ đối với sức khỏe của bạn. Đeo kính bảo hộ, găng tay nitrile dùng một lần và áo khoác phòng thí nghiệm khi thực hiện thử nghiệm nhuộm màu. Khi bạn đã hoàn tất, hãy đặt găng tay và tất cả các vật liệu bị ô nhiễm khác vào một chiếc túi đặc biệt. Hãy nhớ làm theo các quy trình của phòng thí nghiệm của bạn để loại bỏ túi cho các sản phẩm bị ô nhiễm.
3. Đặt mẫu để quan sát trên một phiến kính. Để bắt đầu thử nghiệm, đặt một giọt hoặc mẫu vi khuẩn trên một phiến vô trùng. Sau đó, trượt lưỡi dao qua đầu đốt Bunsen sáng ba lần để cố định mẫu và ngăn không cho nó ra khỏi đĩa khi bạn rửa hoặc thêm thuốc thử.
4. Thêm 5 giọt tinh thể màu tím vào lưỡi dao. Đổ năm giọt dung dịch tím pha lê lên mẫu. Đợi một phút để mẫu hấp thụ pha lê tím.
   • Giữ lưỡi dao đúng vị trí bằng ghim quần áo để bạn không làm bẩn tay.
5. Rửa lưỡi thật kỹ để loại bỏ vết bẩn. Sử dụng một vòi hoặc chai bóp và để nước chảy rất chậm trong tối đa năm giây để loại bỏ cặn mực không bám vào mẫu.
6. Đổ năm giọt Gram Diode Stain lên slide. Nó là một giải pháp bao gồm diode, natri bicarbonate và kali diodide làm cho tinh thể tím tan chảy với thành tế bào của vi khuẩn. Đổ năm giọt dung dịch lên mẫu và để trong một phút.
7. Rửa mẫu bằng cồn hoặc axit lactic. Rượu và lacetone là chất tẩy trắng và sẽ loại bỏ nhuộm thành tế bào vi khuẩn nếu chúng là gram âm. Đổ một vài giọt thuốc tẩy lên mẫu và để nó hoạt động không quá ba giây. Sau đó, thử rửa nhẹ nhàng bằng nước trong năm giây để loại bỏ các chất tẩy trắng này.
   • Nếu bạn cho phép chất tẩy trắng hoạt động trong một thời gian dài, nó có thể dẫn đến sự biến mất của vi khuẩn gram dương nhuộm, dẫn đến âm tính giả.
8. Thực hiện kiểm tra độ tương phản với safranin. Safranin là thuốc nhuộm màu đỏ tương phản với màu tím pha lê, do đó màu của vi khuẩn không bị ảnh hưởng bởi nhuộm màu tím. Đổ khoảng năm giọt safranin lên mẫu và để trong một phút. Sau đó, thử rửa nhẹ nhàng với nước trong năm giây.
9. Hình dung mẫu của bạn ở độ phóng đại 1000X. Các vi khuẩn sẽ trở thành màu tím hoặc tím nếu nó là Gram dương, hoặc màu hồng nếu đó là Gram âm vì safranin.

Phương pháp 2 Thực hiện phép thử nhuộm Ziehl-Neelsen

1. Sử dụng kỹ thuật này để phát hiện vi khuẩn axit nhanh. Những loài này chứa một lượng lớn lipit hơn, khiến chúng có khả năng chống lại thuốc nhuộm được sử dụng trong nhuộm Gram. Các vi khuẩn kháng axit thuộc chi Mycobacterium, bao gồm vi khuẩn chịu trách nhiệm về bệnh lao (M. tuberculosis). Để nhuộm một loại vi khuẩn kháng axit, bạn phải sử dụng thuốc nhuộm màu đỏ có tên là carbolic fuchsin, có khả năng chống rửa bằng dung dịch axit hoặc axit sunfuric.
2. Thực hiện các biện pháp bảo vệ thích hợp. Vật liệu hóa học và sinh học được sử dụng trong nhuộm Ziehl-Neelsen có thể nguy hiểm. Ngoài ra, bạn cũng sẽ cần sử dụng các nguồn nhiệt, chẳng hạn như vòi Bunsen, lò sưởi điện hoặc đèn cồn. Thực hiện theo các hướng dẫn dưới đây để thực hiện kiểm tra.
   • Đeo kính bảo hộ, găng tay nitrile và áo khoác phòng thí nghiệm.
   • Cẩn thận không hít phải hơi từ thuốc nhuộm và thuốc tẩy và đừng để những giọt nước bắn vào mắt hoặc da của bạn. Giữ container mở dưới mui xe.
   • Hãy thật cẩn thận khi làm ấm lưỡi dao. Hầu hết các hóa chất được sử dụng là dễ cháy. Cũng có thể có dấu vết của các chất dễ cháy trên các slide hoặc các thiết bị khác.
3. Chuẩn bị lưỡi dao. Với chuyển động tròn, trải đều một lượng nhỏ mẫu vi khuẩn vào giữa một phiến vô trùng. Mẫu của bạn nên chiếm khoảng 10 mm x 20 mm.
4. Làm khô lưỡi dao. Đặt lưỡi dao lên cấu trúc sấy với mẫu thử hướng lên trên. Để nó khô tự nhiên trong 30 giây. Đừng cố làm khô lưỡi bằng vải.
5. Cố định mẫu bằng nhiệt. Với mẫu thử lên, trượt lưỡi dao hai hoặc ba lần trên đầu đốt Bunsen sáng. Bạn cũng có thể đặt lưỡi dao trên lò sưởi điện bằng cách đặt nhiệt độ trong khoảng từ 65 ° C đến 75 ° C trong ít nhất hai giờ. Cẩn thận không đun sôi hoặc đốt mẫu.
6. Thêm fuchsin carbolic vào lưỡi dao. Đổ vài giọt dung dịch này lên slide. Đổ đủ để phủ hoàn toàn mẫu.
7. Làm nóng lưỡi dao để cố định thuốc nhuộm. Làm ấm cẩn thận slide trên đầu đốt Bunsen hoặc đèn cồn, với mẫu hướng lên trên hoặc đặt trên lò sưởi điện. Làm nóng lưỡi dao đến 60 ° C hoặc cho đến khi nó bắt đầu giải phóng hơi nước. Hãy để thuốc nhuộm hoạt động trong năm phút.
   • Nếu bạn đang sử dụng lò sưởi điện, hãy bật nó ở 60 ° C. Nếu bạn chọn đèn cồn hoặc đầu đốt Bunsen, bạn sẽ thấy khói bốc lên.
   • Để giữ lưỡi dao ở nhiệt độ mong muốn trong năm phút, làm ấm nó liên tục.
   • Cẩn thận không đun sôi, đốt hoặc làm khô mẫu.
8. Rửa sạch lưỡi bằng nước lạnh. Để nguội trong năm phút và rửa nhẹ nhàng trong vài giây với nước sạch. Sử dụng nước máy hoặc chai vắt để loại bỏ các vết nhuộm không bám dính vào mẫu.
9. Đổ vào rượu có tính axit hoặc axit sunfuric. Sử dụng thể tích 3% theo thể tích (v / v) rượu hoặc 20% axit sulfuric để phủ hoàn toàn mẫu. Cho phép axit hoạt động cho đến khi màu nhạt dần và đạt đến một màu hồng rất sáng. Quá trình này thường mất khoảng mười phút.
10. Sử dụng nước sạch để rửa lưỡi dao. Nhẹ nhàng rửa lưỡi dưới vòi nước hoặc sử dụng chai bóp. Loại bỏ tất cả dư lượng axit và thuốc nhuộm.
11. Thêm tác nhân tương phản. Một khi bạn đã rửa sạch slide, đổ vào thuốc nhuộm màu xanh lá cây malachite hoặc xanh methylen. Hai giải pháp này tạo ra một nền màu xanh hoặc hơi xanh mà trên đó thuốc nhuộm màu đỏ sẽ xuất hiện, cũng như các vật liệu sinh học khác, chẳng hạn như tế bào người và vi khuẩn không kháng axit. Để các chất làm việc trong một đến hai phút.
12. Rửa sạch và lau khô lưỡi dao. Rửa kỹ với nước để loại bỏ độ tương phản dư thừa. Khi bạn đã hoàn tất, lau khô mặt sau của lưỡi dao bằng một miếng vải khô và để nó khô tự nhiên trên giá đỡ.
13. Hình dung mẫu của bạn ở độ phóng đại 1000X. Các vi khuẩn kháng axit sẽ chuyển sang màu đỏ hoặc hồng đậm. Các vi khuẩn khác, tế bào không vi khuẩn và cơ sở của lưỡi dao sẽ chuyển sang màu xanh hoặc xanh.

Phương pháp 3 Nghiên cứu hành vi và sự xuất hiện của vi khuẩn

1. Phân tích hình dạng của vi khuẩn. Sau khi thực hiện xét nghiệm nhuộm màu để xác định xem vi khuẩn có gram dương, gram âm hay kháng axit hay không, đã đến lúc xác định loài này chính xác hơn. Đầu tiên, phân tích hình dạng của vi khuẩn trên slide. Ba dạng phổ biến nhất là cocci (hình cầu), xoắn ốc và trực khuẩn (hình que).
   • Có một số biến thể của các hình thức này. Chẳng hạn, vi khuẩn hình tròn (coccus) có thể xuất hiện theo cặp (Diplococci), theo chuỗi, thành từng đống hoặc theo nhóm bốn (tetrads).
2. Tìm hiểu xem vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí. Lấy hai mẫu vi khuẩn và tạo hai mẫu nuôi cấy riêng biệt. Mặt trăng phải kị khí (được trồng mà không có oxy), trong khi mặt kia phải hiếu khí (được trồng bằng oxy). Lưu trữ môi trường nuôi cấy kỵ khí ở 35 ° C ở nơi không có oxy trong ít nhất 48 giờ trước khi quan sát sự tăng trưởng.
   • Nếu vi khuẩn phát triển trong môi trường không có oxy, nhưng không phải khi tiếp xúc với oxy, điều đó có nghĩa là chúng kị khí.
   • Mặc dù chúng phát triển trong môi trường oxy, nhưng không thiếu oxy, chúng hiếu khí.
   • Khi chúng phát triển trong cả hai môi trường, chúng ta nói về vi khuẩn kỵ khí tùy tiện.
3. Thực hiện kiểm tra vận động. Một vi khuẩn là điện thoại di động nếu nó có thể di chuyển một mình với một hoặc nhiều Flagella. Mức độ vận động là rất quan trọng trong việc xác định một số loài vi khuẩn. Có một số loại chuyển động, nhưng cách an toàn và dễ đọc nhất là môi trường bán rắn.
4. Tạo một văn hóa cho các bài kiểm tra động lực. Chuẩn bị nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Thực hiện theo các hướng dẫn dưới đây để chuẩn bị nước dùng bạn chọn.
5. Cấy mẫu cấy trong môi trường thạch bán rắn cho các thử nghiệm vận động. Phủ một phần của môi trường nuôi cấy bằng kim tiêm vô trùng. Cẩn thận trồng kim trong ống dagar bán rắn, chẳng hạn như đầm TTC, mà bạn đã chuẩn bị cho thử nghiệm. Kim phải xuyên qua 2/3 môi trường thạch.
   • Khi bạn đã hoàn tất, cẩn thận tháo kim, chú ý không vượt quá giới hạn của vùng tiêm chủng.
   • Ủ ống ở 30 ° C trong 48 giờ.
6. Đọc kết quả kiểm tra. Môi trường thạch cho thử nghiệm vận động sẽ chuyển sang màu đỏ khi tiếp xúc với vi khuẩn. Nếu chúng là điện thoại di động, tông màu đỏ hoặc hồng này sẽ lan rộng khắp chất. Nếu không, nhuộm sẽ được giới hạn ở vị trí tiêm.

Phương pháp 4 Giải thích tất cả các kết quả

1. Thu thập ý kiến ​​của bạn. Để biết loại vi khuẩn, bạn sẽ cần thu thập thông tin thu được từ các nền văn hóa, các xét nghiệm tô màu và quan sát các hình thức. Nếu bạn đang kiểm tra mẫu bệnh nhân, các triệu chứng họ gặp cũng có thể giúp xác định loại vi khuẩn phù hợp.
   • Ví dụ, nếu các xét nghiệm cho thấy vi khuẩn gram âm, kỵ khí, không vận động và bạn nhận thấy các triệu chứng như đau bụng, buồn nôn và nôn ở bệnh nhân, có khả năng bệnh nhân bị nhiễm Bacteroides. fragilis.
2. Tham khảo cơ sở dữ liệu. Có hàng ngàn loài vi khuẩn trên thế giới. Không thể biết tất cả mọi thứ bằng trái tim. Bạn có thể sẽ cần tham khảo một cuốn sách vi sinh lâm sàng hoặc cơ sở dữ liệu trực tuyến để so sánh kết quả xét nghiệm với thông tin về các loài vi khuẩn.
   • Có các tài nguyên trực tuyến tuyệt vời để xác định vi khuẩn, nhưng hầu hết các cơ sở dữ liệu này đều có sẵn bằng tiếng Anh, bao gồm Patricbrc.org và GlobalRPh. Tuy nhiên, bạn vẫn có thể tìm thấy thông tin hữu ích trên trang web của Trung tâm tài nguyên vi sinh vật quốc tế INRA.
3. Làm một xét nghiệm di truyền để biết chính xác các loài vi khuẩn. Trong một số trường hợp, bạn có thể cần xác định loài vi khuẩn. Phương pháp nhanh nhất và dễ nhất là thực hiện xét nghiệm DNA. Các xét nghiệm DNA cũng hữu ích để xác định vi khuẩn kháng các hình thức nhuộm và nuôi cấy truyền thống. Ngày nay, xét nghiệm DNA trên vi sinh vật rất nhanh và có thể sẵn sàng trong vòng chưa đầy hai giờ.
   • Nếu bạn không có quyền truy cập vào phòng thí nghiệm thực hiện giải trình tự gen của vi sinh vật, hãy gửi mẫu vi khuẩn đến cơ quan chuyên môn.